近日，國際頂級期刊《美國化學(xué)會雜志》（J. Am. Chem. Soc）在線刊發(fā)了我院吳鈺周教授的最新研究成果“Chemogenetic Evolution of Diversified Photoenzymes for Enantioselective [2 + 2] Cycloadditions in Whole Cells” (DOI: 10.1021/jacs.4c03087)。

酶是綠色、高效的生物催化劑，其三維超分子空腔為有機反應(yīng)的精確選擇性控制提供了一個天然的手性環(huán)境，在處理光化學(xué)反應(yīng)中生成的高活性、短壽命的自由基中間體時，這種優(yōu)勢尤為明顯。然而，自然界中的天然光酶種類十分稀缺且催化性能專一性較強，難以滿足當(dāng)前不對稱光催化合成的需求。隨著基因工程、蛋白質(zhì)工程等生物技術(shù)的發(fā)展，通過將合成化學(xué)發(fā)展的光催化劑和光催化機制融合到天然蛋白骨架中構(gòu)建新型人工光酶，極大地拓展了光生物催化的反應(yīng)類型和應(yīng)用范圍。近來，吳鈺周教授團隊基于基因密碼子擴展技術(shù)將二苯甲酮非天然氨基酸引入至蛋白骨架中構(gòu)建三重態(tài)手性人工光酶的研究，成功展示了人工光酶在不對稱光生物轉(zhuǎn)化方面的應(yīng)用潛力(Nature, 2022, 611, 715)，但基因密碼子拓展技術(shù)僅適用于構(gòu)建含特定光敏基團的人工光酶，難以用于高效地篩選大量不同的光敏基團，對引入過渡金屬或者結(jié)構(gòu)復(fù)雜的有機光敏基團也有較大挑戰(zhàn)。相較之下，蛋白質(zhì)化學(xué)修飾技術(shù)可以將不同類型的有機光敏劑定點引入至蛋白骨架中發(fā)展多樣性的人工光酶，但由于難以結(jié)合高通量的定向進(jìn)化過程，至今尚未應(yīng)用于不對稱催化領(lǐng)域。

在本文中，吳鈺周教授團隊提出了一種蛋白質(zhì)化學(xué)遺傳修飾的方法，適用于構(gòu)建結(jié)構(gòu)、性質(zhì)以及功能各異的手性人工光酶，為激發(fā)態(tài)光反應(yīng)的手性控制難題提供了新的解決方案。團隊首先利用蛋白半胱氨酸巰基官能團較強的親核性，將合成化學(xué)發(fā)展的各類高效有機光敏劑定點插入到選定蛋白的手性空腔中，構(gòu)建了化學(xué)修飾的人工光酶酶庫CMP。由于這類有機光敏劑均具有優(yōu)異的三重態(tài)光物理性質(zhì)且發(fā)色團吸收范圍涵蓋廣，該光酶酶庫能夠在不同工作波長下催化底物從分子基態(tài)躍遷到激發(fā)態(tài)發(fā)生光反應(yīng)，其中含噻噸酮光敏中心的CMP1.0被鑒定為催化紫外敏感型底物2-羧基酰胺吲哚烯基不對稱[2+2]光環(huán)加成反應(yīng)的最佳初代人工光酶。

通過探究和優(yōu)化化學(xué)修人工光酶的高效定向進(jìn)化方法，團隊建立了可以基于細(xì)胞裂解液進(jìn)行蛋白質(zhì)定點化學(xué)修飾的突變體篩選流程，無需經(jīng)過分離純化，即可進(jìn)行高通量定向進(jìn)化。最終經(jīng)四輪突變迭代優(yōu)化CMP1.0的氨基酸殘基和反應(yīng)空腔結(jié)構(gòu)，獲得具有優(yōu)異催化性能的突變體CMP4.0，該人工光酶能夠高效催化烯基吲哚分子內(nèi)[2+2]光環(huán)加成反應(yīng)，所獲得的環(huán)丁烷吲哚啉產(chǎn)物具有較好的底物普適性和優(yōu)異的對映選擇性（最高可以獲得96:4 e.r.值）。經(jīng)CMP4.0晶體結(jié)構(gòu)解析及計算輔助蛋白質(zhì)模擬分析，闡明了反應(yīng)優(yōu)異的對映選擇性來源于光敏基團和周邊關(guān)鍵氨基酸殘基與底物之間形成的π-π堆積等多重弱鍵協(xié)同作用。

基于CMP4.0優(yōu)異催化性能及可見光吸收特性，團隊進(jìn)一步使用表達(dá)CMP4.0的重組大腸桿菌細(xì)胞探索了全細(xì)胞光生物催化，實現(xiàn)了化學(xué)遺傳修飾法構(gòu)建的人工光酶于胞內(nèi)催化高效對映選擇性光環(huán)加成反應(yīng)，是人工光酶在全細(xì)胞不對稱光催化方向的突破性進(jìn)展，展示了基于化學(xué)遺傳修飾法構(gòu)建人工光合成細(xì)胞的可能。這項研究發(fā)展了高效的人工光酶構(gòu)建策略，將從根本上豐富人工光酶的種類，為解決能量轉(zhuǎn)移不對稱光催化反應(yīng)中的手性控制難題以及拓寬不對稱光生物催化反應(yīng)性提供了新的方案，也為發(fā)展其他含非天然輔因子的新型高效人工光酶提供了研究基礎(chǔ)。

我院吳鈺周教授為本文通訊作者。我院2020級博士研究生郭娟為論文第一作者，華中科技大學(xué)為唯一通訊單位。該研究工作得到了國家重點研發(fā)計劃項目（2018YFA0903500）資助。